Интересные новости и факты (биология, химия)

[ArefievPV]

Создана искусственная жизнь из «зомби-клеток»: найден способ пересаживать синтетическую ДНК без отторжения
https://www.ixbt.com/live/science/sozdana-iskusstvennaya-zhizn-iz-zombi-kletok-nayden-sposob-peresazhivat-sinteticheskuyu-dnk-bez-ottorzheniya.html

Создание синтетических организмов — важная задача современной биологии. Технология конструирования геномов с нуля позволяет создавать микроорганизмы с заданными свойствами, которые могут производить редкие медицинские препараты, перерабатывать пластик или синтезировать экологически чистое топливо. Однако на пути к массовому применению этой технологии стояла проблема, связанная с естественными защитными механизмами живых клеток.

Исследователи из Института Крейга Вентера опубликовали работу, в которой описали метод обхода биологических ограничений. Они доказали, что для успешной пересадки искусственного генетического кода клетку-реципиента необходимо предварительно умертвить. Разработанный ими протокол позволяет внедрять синтетическую ДНК в биологически неживую оболочку, после чего клеточные процессы восстанавливаются, и организм начинает функционировать исключительно по новому коду. Этот подход решает проблему, которая сдерживала развитие отрасли более десяти лет.

Проблема гомологичной рекомбинации и ложных результатов

В 2010 году Институт Крейга Вентера впервые в истории успешно внедрил полностью синтетический геном в живую бактерию. Этот процесс получил название полногеномной трансплантации (Whole Genome Transplantation, или WGT). Суть метода заключалась в том, что ДНК, собранная в лаборатории, помещалась внутрь бактерии-реципиента, после чего клетка начинала считывать новую информацию и менять свои свойства.

Но вскоре ученые столкнулись с серьезным ограничением. Метод WGT безотказно работал только в пределах очень узкой группы бактерий — микоплазм (в частности, таксона Mycoides). Как только исследователи пытались применить эту технологию к другим видам микроорганизмов, эксперименты заканчивались неудачей. Причиной стал процесс, известный в биологии как гомологичная рекомбинация.

Гомологичная рекомбинация — это базовый механизм восстановления и обмена генетической информацией, присутствующий у большинства живых существ. Когда ученые внедряли гигантскую молекулу синтетической ДНК в живую бактерию других видов, клетка воспринимала ее как материал для взаимодействия.

Чтобы отслеживать успешность трансплантации, ученые всегда встраивали в искусственный геном ген устойчивости к определенному антибиотику. После проведения процедуры трансплантации все клетки помещались в среду, содержащую этот антибиотик. Предполагалось, что исходные клетки погибнут, а выживут только те, которые успешно приняли новый синтетический геном и приобрели устойчивость.

Однако из-за активности ферментов гомологичной рекомбинации живые бактерии-реципиенты не заменяли свой геном целиком. Вместо этого они просто вырезали из плавающей внутри них синтетической ДНК небольшой фрагмент, содержащий ген устойчивости к антибиотику, и встраивали его в свою собственную, оригинальную хромосому. Оставшаяся часть искусственного генома при этом разрушалась.

В результате на питательной среде с антибиотиком вырастали колонии бактерий. Ученые фиксировали положительный результат, но при детальном анализе выяснялось, что это ложное срабатывание. Выжившие колонии состояли из старых бактерий-реципиентов, которые лишь слегка модифицировали свою ДНК, а не из новых организмов, управляемых полностью искусственным кодом. Стало очевидно, что для успешной пересадки необходимо найти способ полностью деактивировать собственный геном реципиента до того, как он вступит в реакцию с новой ДНК.


Обработка митомицином С (MMC) перед процедурой WGT инактивирует клетки-реципиенты, но сохраняет их способность принять новый геном.
(a) Схема классической процедуры полногеномной трансплантации (WGT). Донорский геном JCVI-syn1.0, содержащий ген устойчивости к тетрациклину, пересаживают в активные клетки-реципиенты M. capricolum. При помещении на питательную среду с антибиотиком сохраняются только успешные трансплантаты, принявшие новую ДНК.
(b) Механизм ложного срабатывания из-за гомологичной рекомбинации на примере бактерий M. genitalium. Вместо того чтобы принять искусственную хромосому целиком, бактерия-реципиент вырезает из донорской ДНК только нужный фрагмент (маркер устойчивости к канамицину) и встраивает его в свой родной геном. В результате на среде с антибиотиком продолжают расти старые бактерии, давая ложноположительный результат.
(c) Схема трансплантации без использования антибиотиков (новый метод). Добавление MMC химически «сшивает» собственную ДНК клеток-реципиентов M. capricolum, необратимо блокируя их жизнедеятельность. Однако те неактивные оболочки, внутрь которых попадает донорский геном, полностью восстанавливают свои функции.
(d) Определение минимальной дозы MMC, необходимой для подавления активности клеток M. capricolum. Это позволило подобрать идеальную концентрацию для экспериментов с WGT.
(e) График падения жизнеспособности клеток M. capricolum в зависимости от увеличения концентрации MMC и времени воздействия.
(f) Влияние дозы MMC на жизнеспособность клеток и эффективность самой трансплантации. При оптимальной дозировке активность старых клеток-реципиентов падает колоссально — примерно в миллион раз (≈10⁶), тогда как эффективность внедрения нового генома снижается лишь в 10 раз. При слишком высоких дозах MMC (20 и 25 мкг/мл) трансплантация становится невозможной. (На графике пустые кружки обозначают результаты отдельных экспериментов, а закрашенные — средние значения).
Автор: Zumra Peksaglam Seidel et al. Источник: www.biorxiv.org

Избирательная химическая инактивация ДНК

Самым логичным решением было отключить исходную ДНК клетки. Однако стандартные методы уничтожения бактерий, такие как радиационное облучение, сильный нагрев или воздействие агрессивных кислот, не подходили. Эти методы физически разрушают все структуры клетки: клеточную мембрану, рибосомы, белки и ферменты. Если разрушить этот аппарат, клетка потеряет способность прочитать любую ДНК, включая искусственную. Трансплантация станет невозможной.

Исследователям требовался метод, который воздействовал бы исключительно на генетический материал, оставляя все остальные клеточные компоненты нетронутыми. Они обратились к химическим веществам, способным формировать необратимые связи внутри молекулы ДНК.

Основным инструментом в исследовании стал митомицин С (MMC) — химическое соединение, относящееся к классу алкилирующих агентов. При попадании в клетку митомицин С избирательно находит гуаниновые основания в ДНК и образует между ними прочные ковалентные связи. ДНК представляет собой двойную спираль, нити которой должны расплетаться в процессе деления клетки или при считывании информации. Митомицин С скрепляет эти две нити вместе. Из-за таких химических сшивок механизмы репликации останавливаются. Бактерия необратимо теряет способность копировать свой геном и делиться. С биологической точки зрения она становится мертвой (Моё примечание: некорректное умозаключение, что становится мёртвой.).

Ученые провели серию экспериментов на бактериях Mycoplasma capricolum, чтобы найти идеальную дозировку. Выяснилось, что при концентрации митомицина С в 2,5 микрограмма на миллилитр и времени воздействия в два часа достигается нужный эффект. Собственный геном бактерии полностью выводится из строя, но рибосомы, транскрипционные ферменты и клеточная мембрана сохраняют свою функциональность. Клетка мертва для деления (Моё примечание: вот именно – она «мертва» только для деления.), но ее механизмы синтеза белка готовы к работе.

Для подтверждения того, что успех обусловлен именно принципом связывания ДНК, а не уникальными свойствами конкретного химиката, ученые протестировали другое вещество — псорален. Псорален проникает между парами оснований ДНК, но активируется и создает сшивки только под воздействием ультрафиолетового излучения (UVA). Эксперимент показал аналогичные результаты, доказав, что контролируемая инактивация ДНК является универсальным подходом.


Обработка MMC делает возможной процедуру WGT в инактивированных клетках-реципиентах.
На схемах показано сравнение трансформации плазмиды (кольцевой молекулы ДНК) в (a) активных и (b) лишенных жизнеспособности клетках-реципиентах. Бактерии с химически заблокированным геномом оказались неспособны к трансформации плазмиды. Эффективность этого процесса сравнили с полногеномной трансплантацией (WGT) после воздействия MMC.
Результаты экспериментов с клетками, обработанными препаратом в дозе 2,5 или 5 мкг/мл в течение двух часов (c), а также 10 мкг/мл в течение одного часа (d), доказывают, что пересадка генома успешно проходит даже в полностью неактивных клеточных оболочках. Цифры в скобках указывают на количество оставшихся жизнеспособных клеток для каждого из условий.
Автор: Zumra Peksaglam Seidel et al. Источник: www.biorxiv.org

Процесс трансплантации без использования антибиотиков

Получив раствор с неживыми бактериями (Моё примечание: Не «с неживыми» бактериями, а с бактериями с «отключенной» ДНК.) Mycoplasma capricolum, исследователи приступили к этапу внедрения синтетического генома. В качестве донорского материала использовалась искусственная хромосома JCVI-syn1.0. С помощью химических реагентов (кальция хлорида и полиэтиленгликоля) клеточные мембраны бактерий делали проницаемыми, чтобы массивная молекула ДНК могла проникнуть внутрь.

Поскольку собственный геном реципиентов был разрушен митомицином С, процесс гомологичной рекомбинации физически не мог запуститься. Оболочка приняла донорскую ДНК. Оставшиеся внутри клетки активные транскрипционные ферменты начали взаимодействовать с новым генетическим кодом. Они стали синтезировать новые матричные РНК, которые затем передавались на рибосомы для производства белков, закодированных в синтетической хромосоме. Клеточная активность полностью восстановилась.

Самым важным достижением этого протокола стала возможность полного отказа от антибиотиков при отборе успешных трансплантатов. В классическом методе на чашках Петри без антибиотика вырастал бы сплошной слой старых бактерий, среди которых невозможно было бы найти несколько клеток с новым геномом. В новом эксперименте исследователи высеивали результаты на обычную питательную среду без добавления токсичных веществ.

Так как все исходные клетки были предварительно умерщвлены (Моё примечание: не были они умерщвлены.) митомицином С, они не могли делиться и образовывать колонии. Единственными клетками, которые демонстрировали рост и деление на питательной среде, оказались те бактерии, которые успешно приняли внутрь себя синтетический геном JCVI-syn1.0.

Для визуального подтверждения в синтетическую хромосому был заранее внедрен ген lacZ. Бактерии, обладающие этим геном, при взаимодействии со специальным веществом в питательной среде окрашиваются в синий цвет. Все выросшие колонии оказались синими. Дополнительный лабораторный анализ с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР), который проверил одиннадцать специфических участков ДНК, окончательно подтвердил: выросшие бактерии обладают исключительно синтетическим геномом. Никаких следов старой ДНК Mycoplasma capricolum в активном виде обнаружено не было.

Исследователи подсчитали эффективность нового метода. При использовании живых реципиентов успешная пересадка происходила примерно в одном случае на 150 миллионов клеток. При использовании неживых клеток общее количество выживших микроорганизмов резко упало, но относительная эффективность внедрения новой ДНК возросла. Один успешный трансплантат приходился всего на 288 жизнеспособных клеток. Это означает увеличение эффективности процедуры более чем в 500 000 раз.


Обработка MMC в процессе WGT позволяет отказаться от использования антибиотиков для отбора трансплантатов. Ученые сравнили эффективность метода WGT с использованием антибиотиков и без них, проводя процедуру как с предварительной обработкой MMC, так и без нее. (a) Фотографии чашек Петри с питательной средой. Белые колонии — это исходные клетки M. capricolum, синие — успешные трансплантаты JCVI-syn1.0. Геном JCVI-syn1.0 содержит маркер устойчивости к тетрациклину, поэтому он способен расти на среде как с антибиотиком, так и без него. Исходные же клетки M. capricolum растут только на среде без антибиотика. (b) Культивирование образцов в пробирках со средой SP4. Рост бактерий сопровождается повышением кислотности среды, из-за чего индикатор (феноловый красный) меняет цвет с красного на желтый. (c) Генетическое подтверждение состава колоний с помощью мультиплексной ПЦР. Тесты (b) и (c) подтвердили, что белые колонии состоят из исходных клеток, а синие являются трансплантатами JCVI-syn1.0. (d) Измерение эффективности трансплантации для обычных и инактивированных (обработанных MMC) клеток-реципиентов при использовании донорских геномов, полученных из бактерий или дрожжей. (e) Сравнение количества колоний на средах без антибиотиков. Без предварительной блокировки исходного генома обычные клетки-реципиенты растут слишком плотно, образуя сплошной «газон». Это делает невозможным выделение отдельных трансплантатов без применения антибиотиков. (На графиках (d) и (e) представлены средние арифметические значения, а планки погрешностей отражают стандартное отклонение по результатам трех независимых биологических опытов).
Автор: Zumra Peksaglam Seidel et al. Источник: www.biorxiv.org

Значение для науки и биотехнологий

Этот эксперимент наглядно демонстрирует, что граница между живой и неживой клеткой определяется не столько физической целостностью организма, сколько способностью генома к репликации (Моё примечание: зрелый эритроцит тоже неживой, что ли? У него ДНК вообще нет.). Процесс загрузки жизни не требует полностью функционального реципиента. Минимально необходимым условием является наличие неповрежденного транскрипционного и трансляционного аппарата.

На практике этот прорыв снимает главное техническое препятствие для расширения методов синтетической биологии. Исключение проблемы гомологичной рекомбинации означает, что ученым больше не нужно ограничиваться только микоплазмами. Технология открывает путь к стандартизации процесса. В будущем исследователи смогут подготавливать универсальные, лишенные собственной генетической информации клеточные оболочки различных видов бактерий.

Эти подготовленные пустые клетки будут служить базовыми платформами для внедрения любых спроектированных на компьютере генетических последовательностей. Такая технология многократно ускорит создание специализированных микроорганизмов для нужд медицины (например, для синтеза сложных белковых соединений и новых антибиотиков), биотехнологической промышленности и защиты окружающей среды, позволяя конструировать живые системы с такой же точностью, с какой инженеры собирают сложные технические устройства.

Источник: biorxiv

P.S. Проводить границу между живым и неживым по способности к репликации (например, «отключив/заблокировав» ДНК) некорректно. Эритроциты в зрелом состоянии ДНК вообще не имеют. У человека они живут в таком виде примерно 120 суток.

Эритроциты
https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%AD%D1%80%D0%B8%D1%82%D1%80%D0%BE%D1%86%D0%B8%D1%82%D1%8B

Зрелый эритроцит, с диаметром 7—8 мкм, не имеющий ядра и ДНК (в центре — просветление), цитоплазма — розово-красная.
...
Продолжительность жизни эритроцита человека около — 120 суток

[ArefievPV]

Одноклеточный хищник заставил украденные хлоропласты работать за счет собственных белков
https://naked-science.ru/article/biology/odnokletochnyj-hishhnik-z
Японские биологи экспериментально подтвердили, что одноклеточный жгутиконосец Rapaza viridis не просто сохраняет проглоченные хлоропласты водорослей, но и поддерживает их работу с помощью белков собственного ядра. Хищник заново собирает систему биохимического контроля над присвоенной органеллой после каждого приема пищи. Это первый доказанный биохимический пример временного молекулярного химеризма у эукариот.

Эволюционная биология утверждает, что хлоропласты и митохондрии когда-то были свободными бактериями, которых поглотили предки современных эукариот. Превращение съеденной добычи в постоянный «орган» занимает миллионы лет. В природе существует клептопластия — способность организмов воровать чужие пластиды и временно использовать их для фотосинтеза, отбрасывая остальную часть клетки-жертвы.

До сих пор исследователи располагали лишь косвенными генетическими данными о том, что ядро хищника отправляет белки внутрь временно украденной органеллы, чтобы продлить ей жизнь. Строгих биохимических доказательств такого молекулярного взлома не существовало.

Авторы исследования, опубликованного в журнале Nature Communications, изучили клептопластию у одноклеточного эвгленозоя Rapaza viridis, который поедает зеленые водоросли рода Tetraselmis. Хищник переваривает ядро и цитоплазму жертвы, оставляя нетронутыми хлоропласты, которые затем использует по их назначению, то есть для фотосинтеза. Ученые проанализировали транскриптом жгутиконосца на разных стадиях пищеварения и нашли 37 активных генов, кодирующих белки, похожие на компоненты фотосинтетического аппарата.

Чтобы детально проверить механизм, авторы научной работы выбрали два белка, подобные RvRbcS и RvRca, малой субъединице и активатору фермента Рубиско, ключевого фермента фотосинтеза. Исследователи синтезировали светящиеся антитела, реагирующие только на эти молекулы. С помощью иммунофлуоресцентного микроскопа они проследили путь белков внутри клетки. Светящиеся маркеры показали, что белки хищника успешно проникают сквозь мембраны чужого хлоропласта и скапливаются внутри него.

Затем ученые проверили, так ли уж нужны эти белки хлоропласту. Биологи применили генетический редактор CRISPR/Cas9 и целенаправленно вырезали гены, отвечающие за производство RvRbcS- и RvRca-подобных белков, у хозяина.

Мутация генов резко снизила эффективность фотосинтеза. Клетки с удаленным геном RvRbcS-like вырабатывали кислород вдвое слабее обычных особей. Жгутиконосцы перестали накапливать гранулы полисахаридов (энергетические запасы) и начали массово погибать уже на 22-й день после поглощения водоросли, тогда как здоровые микроорганизмы поддерживают жизнь хлоропласта около пяти недель.

Анализ структуры белка RvRbcS-like помог выявить у него длинный С-концевой участок, которого нет у оригинальных белков водоросли-жертвы. Исследователи предполагают, что этот белковый «хвост» помогает хищнику физически перестраивать пиреноид — внутрихлоропластную зону фиксации углерода — под свои нужды. В отличие от растений, чьи хлоропласты работают как постоянная часть клетки, Rapaza viridis собирает транспортную систему с нуля после каждой успешной охоты.

Эукариоты способны создавать временные гибридные клеточные структуры, объединяя собственные генетические ресурсы с биохимией захваченных пластид. Способность синтезировать белки и целенаправленно отправлять их сквозь мембраны временно поглощенных органелл демонстрирует промежуточный эволюционный этап между обычным хищничеством и полноценным симбиозом.

[ArefievPV]

Мышь смогли клонировать 58 раз
https://nplus1.ru/news/2026/03/26/mice-cloning-limit
Больше не получилось из-за накопления в клонах мутаций

Японские ученые на протяжении 20 лет последовательно клонировали мышей и наконец достигли предела, после которого у них перестали получаться жизнеспособные особи. По мнению авторов статьи, опубликованной в Nature Communications, проблемы, повлекшие за собой гибель 58 поколения, связаны не с эпигенетическими нарушениями, а с накоплением мутаций.

Эта работа затрагивает фундаментальный вопрос о том, зачем животным половое размножение. Считается, что при отсутствии рекомбинации запускается храповик Мёллера — процесс необратимого накопления вредных мутаций в популяциях, приводящий к снижению уровня адаптации. Тем не менее в мире есть организмы, для которых бесполое размножение совершенно естественно или даже является основным способом размножения. Среди них есть и грибы, и растения, и животные, однако млекопитающие в ста процентах случаев полагаются на половое размножение.

Успехи по клонированию животных сделали возможным проверить предположение о том, что произойдет, если все-таки заставить млекопитающих размножаться клонированием. У этого метода оказалась низкая эффективность, и он связан с частыми аномалиями развития. Считается, что их причина — сбои в перепрограммировании ядра донорской клетки, однако точные механизмы этих нарушений до сих пор неясны.

Саяка и Терухико Вакаяма (Sayaka Wakayama, Teruhiko Wakayama) и их коллеги из Университета Яманаси объявили о завершении своего 20-летнего эксперимента, призванного ответить на этот вопрос. Начиная с января 2005 года, они брали ядро клетки мыши-донора, пересаживали его в яйцеклетку реципиента, выращивали из него новых мышей-доноров и повторяли цикл. Первые два десятка поколений клонированных мышей достаточно легко давали потомство, но на 27 поколении рождаемость начала снижаться. А 58 поколение стало последним — мышата не прожили и суток.

Чтобы проверить, что именно пошло не так, исследователи сравнили мышей разных поколений клонов (технически называть их поколениями, конечно, не совсем корректно). Хотя у клонов наблюдались отличия от контроля (увеличенная плацента, увеличенная масса тела и эпигенетические особенности), они не нарастали от поколения к поколению. Эпигенетические метки, качество эмбрионов и другие параметры оставались сопоставимыми между ранними и поздними клонами. Кроме того, выжившие животные сохраняли нормальную продолжительность жизни и общее здоровье. В итоге авторы делают вывод, что отклонения не связаны с ухудшением приспособленности и не накапливаются при серийном клонировании.

Чтобы отделить вклад эпигенетики и техники клонирования, исследователи проверили, как развиваются ооциты реклонов при обычном оплодотворении. Выяснилось, что ооциты клонированных мышей имеют качество хуже, чем обычные: даже при оплодотворении нормальной спермой большинство эмбрионов не развивалось до стадии бластоцисты. Тем не менее малой части эмбрионов, полученных из поздних поколений клонов удалось выжить. Исследователи считают, что к коллапсу клонирования привели не сбои эпигенетического перепрограммирования, а накопившиеся мутации. При этом возврат к половому размножению позволил успешным эмбрионам частично сбросить этот груз.

Авторы статьи показали, что количество мутаций на поколение у клонированных мышей было выше, чем у обычных, а после 25 поколения начали накапливаться и крупные хромосомные аномалии. Тому есть несколько причин.

Во-первых, для клонирования брались соматические клетки, которые уже прошли много раундов деления внутри организма мыши и, соответственно, накопили мутации.

Во-вторых — и это самое важное по мнению авторов, — отсутствие рекомбинации помешало клонам избавиться от накопившихся за поколения мутаций, так что доля выживающих мышей на поздних этапах эксперимента становилось все меньше и меньше.

Однозначного объяснения тому, почему мыши с накопленными мутациями не стали чаще болеть и меньше жить, авторы не дают, но предполагают, что выживали только те особи, у которых мутационная нагрузка еще совместима с жизнью. В их эксперименте шел жесткий эмбриональный отбор, и по падению эффективности клонирования видно, что новые поколения проходили его все хуже.

Авторы приводят результаты своей работы как пример действия храповика Мёллера, подчеркивая, что ключевая проблема в их случае связана не с эпигенетическими проблемами, связанными с самой методикой клонирования, а тем, что при клонировании отсутствуют рекомбинация и механизмы очистки генома от вредных мутаций.

Клонирование — это в том числе и перспективный метод сохранения редких видов. Мы рассказывали о том, как зоологи впервые получили потомство от клонированной самки американского хорька. А еще о том, как на свет появилась первая клонированная лошадь Пржевальского.